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适用专业：预防兽医学
适用年级：大学
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论文编号：197582
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硕士论文-猪圆环病毒2型双拷贝感染性DNA构建和小鼠感染模型研究，共58页，33244字
摘 要
猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科，是一种小的，无囊膜的
单链负股环状 DNA 病毒。分为无致病性的 PCV1 和有致病性的 PCV2 两个基因型。本研究
分离鉴定了一株 2 型猪圆环病毒，成功构建 PCV2 双拷贝感染性克隆，对 PCV2 感染小鼠
模型进行了初步研究，结果表明：PCV2 可在 Balb/c 小鼠体内增殖,并且可在小鼠中通过
接触水平传播。
采用无 PCV 污染的 PK-15 细胞系，从经 PCR 检测为 PCV2 阳性、临床表现为 PMWS 的
脾脏及淋巴组织病料中分离到一株猪 2 型圆环病毒,命名为 SD-2（DQ478947）。经系列传
代后，第 20 代毒价达 106.2 TCID50 /mL。分别用 PCR、间接免疫荧光试验（IFA）及透射
电镜鉴定 PK-15 细胞上 PCV2 复制增殖情况。结果表明：从接毒的 PK-15 细胞中均扩增
出了 700 bp 左右的 PCV2 特异条带；IFA 试验显示病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质
中；透射电镜下可见到典型的 PCV2 病毒粒子，直径约为 17nm。病毒基因组由 1768 个核
苷酸组成，与 GenBank 上登录的其它 PCV2 全基因序列同源性达 95.5%-99.7%。用 0.2mL
的 PCV2 SD-2 病毒细胞培养物（106.2 TCID50/ml）接种 3 周龄昆明小鼠，一周后在小鼠体
内重新检测到 PCV2 SD-2。
感染性分子克隆是研究病毒复制和致病机制的有力工具。本研究应用 PCR 诱变技术
解决了同源线性片段易于自连的难题，成功将两个 PCV2 SD1 株全基因组（DQ346683）
头尾相接插入到真核表达载体 pSK 的多克隆位点中，构建重组质粒 pSK-2PCV2。将所得
质粒转染无 PCV 污染的 PK-15 细胞系，经 10 次连续传代后，间接免疫荧光试验检测显
示细胞核中含有大量的病毒抗原；提取 mRNA 后经 RT-PCR 检测有 PCV2 特异性基因转录；
透射电镜下可观察到直径约为 17～20nm 的典型 PCV2 病毒粒子；经测序鉴定所拯救出的
病毒与亲本病毒核苷酸同源性为 100%。所构建的重组质粒经表达后可在体外组装出有感
染性的 PCV2 病毒粒子，拯救出的 PCV2 与亲本病毒具有相同的生物学特性。将所得重组
质粒接种 Balb/c 小鼠，未能获得拯救出的病毒，推测可能是由于质粒未能进入小鼠细
胞内，而被代谢掉的原因。
将 30 只 6 周龄 SPF Balb/c 小鼠随机分为四组，其中：对照组 5 只（C1-C5），在第
1 天接种 RPMI-1640 培养液，接种途径为：腹腔注射 0.1mL、肌肉注射 0.1mL、鼻腔 0.01mL。
一次攻毒组 15 只（S1-S15），在第 1 天接种 PCV2，接种途径和剂量同对照组。连续攻
毒组 5 只（M1-M5），在第 1、7、14、21、28 天分别接种 PCV2，每次接种途径及剂量均
与对照组相同，同时在连续攻毒组内放入 5 只未接种 PCV2 Balb/c 小鼠（CM1－CM5），
用于检测 PCV2 在小鼠中是否可通过接触传染。在攻毒后第 7、14、21 和 35 天从一次攻
毒组中随机选择 3 只小鼠采血并处死，连续攻毒组对照组及 CM 组在攻毒后 35 天采血处
死。结果表明，C 组体重增长速率略高于 M 组；S 组、CM 组和 M 组体内存在病毒复制，C
组体内无病毒复制；S 组、CM 组和 M 组均产生 PCV2 抗体，但 M 组抗体水平明显高于 S
组和 CM 组，C 组未检测到 PCV2 抗体；S 组、CM 组和 M 组有明显的病理损伤，其中脾脏、
淋巴结损伤最为严重，C 组未发现病理损伤。根据攻毒组小鼠脾脏、淋巴结内持续的病
毒复制、血清 PCV2 抗体生成、明显的病理损伤得出 PCV2 感染 Balb/c 小鼠的结论，本
试验初步建立了 PCV2 感染 Balb/c 小鼠的动物模型，并发现证明了 PCV2 可在 Balb/c 小
鼠中通过接触水平传播。这为 PCV2 的致病机理研究及疫苗免疫效果评价等奠定了理论
基础。
关键词：猪圆环病毒 2 型；分离鉴定；体外拯救；双拷贝感染性 DNA 克隆；动物模
型
目录
中文摘要………ⅰ
英文摘要………ⅲ
英文缩略词……ⅴ
文献综述 ……… 1
研究报告
试验一：山东 猪圆环病毒 2 型毒株的分离鉴定 … 17
1 材料与方法… 17
2 结 果 … … … … …… … … 19
3 讨 论 … … … … … …… …… 22
试 验 二： 猪 圆环 病毒 2 型 SD1 株 双 拷贝感染 性 DNA 构 建 … … ……… … 24
1 材料与方法… 24
2 结 果 … … … … …… … …… … 26
3 讨 论 … … … … …… … …… 29
试验三： PCV2 感染 Balb/c 小鼠动物模型的建立…… 31
1 材 料与方法 31
2 结果………… 34
3 讨论………… 37
结论 39
参考文献 ……… … ……… 40
硕士期间发表文章……… 46
致谢 47
导师组意 见 …… … ……… 48
学位论文独创性声明…… 49
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- 硕士论文-猪圆环病毒2型双拷贝感染性DNA构建和小鼠感染模型研究
硕士论文-猪圆环病毒2型双拷贝感染性DNA构建和小鼠感染模型研究.doc [1.17MB]
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发表于 2011-7-16 12:38:27